1. 儲(chǔ)存液的配制(50mg/ml)
稱取0.5g 潮霉素B加入10ml無(wú)菌去離子水內(nèi)使其*溶解。先用5ml無(wú)菌去離子水預(yù)濕潤(rùn)0.22μm針頭式過(guò)濾器，除盡水。之后使用此濾器過(guò)濾潮霉素B溶液，除菌后分裝成單次使用的小量(如1ml)放到-20℃凍存，約1年穩(wěn)定。
2. 常用篩選濃度
注意：潮霉素B用來(lái)篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株的工作濃度需要根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型，培養(yǎng)基，生長(zhǎng)條件和細(xì)胞代謝率而變化，推薦使用濃度為50-1000μg/mL。對(duì)于*次使用的實(shí)驗(yàn)體系建議通過(guò)建立殺滅曲線(kill curve)，即劑量反應(yīng)性曲線，來(lái)確定*篩選濃度。
一般而言，哺乳動(dòng)物細(xì)胞50-500μg/mL;細(xì)菌/植物細(xì)胞20-200μg/mL;真菌300-1000μg/mL。
3. 殺滅曲線的建立
注意：為了篩選得到穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株，需要確定能夠殺死未轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的抗生素zui低濃度，可通過(guò)建立殺滅曲線(劑量反應(yīng)曲線)來(lái)實(shí)現(xiàn)，至少選擇5個(gè)濃度。
1) *天：未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞按照20-25%的細(xì)胞密度鋪在合適的培養(yǎng)板上，37℃，CO2培養(yǎng)過(guò)夜;注：對(duì)于需要更高密度來(lái)檢測(cè)活力的細(xì)胞，可增加接種量。
2) 根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型，設(shè)定合適范圍內(nèi)的濃度梯度。以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為例，可設(shè)定50，100，250，500，750，1000μg/mL。先用去離子水按照1:10的比例將母液稀釋到5 mg/ml，然后按照下表稀釋到相應(yīng)濃度的工作液。
3) 第二天：替換舊的培養(yǎng)基，換用新鮮配制的含有相應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)基。每個(gè)濃度做三個(gè)平行孔。
4) 接下來(lái)每3-4天更換新的含藥物培養(yǎng)基。
5) 按照固定的周期(如每2天)進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)確定阻止未轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)的恰當(dāng)濃度。選擇在理想的天數(shù)(通常是7-10天)內(nèi)能夠殺死絕大多數(shù)細(xì)胞的zui低濃度為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選用的工作濃度。